序文#
胃癌、特に胃腺癌（GAC）はその主要な組織学的タイプであり、世界で最も一般的な悪性腫瘍の一つであり、癌関連の死亡の主要な原因の一つでもあります。相当数の胃癌患者は末期に診断されており、これは治療の有効性と患者の予後を大きく制限しています。手術切除は依然として治療の必須の柱ですが、JCOG9501 や JCOG9502（日本臨床腫瘍研究グループのシリーズ研究）を含むいくつかの研究は、胃癌患者が拡大切除から利益を得ないことを示しています。過去 10 年間、新補助療法と周術期治療は新たな希望をもたらしました。MAGIC 試験は、切除可能な II/III 期胃癌患者に対して、3 回の術前および 3 回の術後の ECF（エピルビシン、シスプラチン、5 - フルオロウラシル）化学療法を行うことで、手術のみの場合と比較して 5 年生存率を 23% から 36% に引き上げることができることを示しました（MAGIC: the Medical Research Council Adjuvant Gastric Infusional Chemotherapy）。FLOT4-AIO 試験はさらに、ECF または ECX（エピルビシン、5 - フルオロウラシル、カペシタビン）と比較して、FLOT（5 - フルオロウラシル、葉酸、オキサリプラチン、ドセタキセル）プロトコルがより良い病理反応率、R0 切除率、全生存（OS）をもたらすことを示しました。術前化学療法が根治的切除の機会を増加させ、早期の微小転移を排除し、補助療法に対する術前反応評価を可能にすることが認識されています。免疫チェックポイント阻害剤（ICIs）などの新薬の登場に伴い、化学療法は依然として胃癌の周術期治療における最も基本的かつ入手可能な要素です。
一方で、胃癌における術前治療は、特に東アジア諸国では依然として議論の余地があります。術前化学療法に対する反応には異質性があり、そのメカニズムについての理解は限られています。患者の術前化学療法反応を予測するバイオマーカーが必要であり、患者に最適な治療層別化を行う必要があります。新たに出現した証拠は、免疫が患者の化学療法に対する反応に関与していることを示唆しています。Choi らは、腫瘍標本中の基質プログラム細胞死リガンド 1（PD-L1）の発現が、II/III 期胃癌の D2 胃切除後の補助化学療法の利益を予測できることを報告しました。Kim らは、標準的な一線化学療法期間中にペアの術前および治療中の胃生検サンプルを使用し、化学療法が自然殺傷細胞（NK）の浸潤、マクロファージの極性化、および治療反応者における抗原提示の増加を誘発することを発見しました。しかし、胃癌免疫学の既存の研究は主に腫瘍微小環境（TME）における局所免疫反応に焦点を当てており、全身免疫と胃癌化学療法反応との関係についてはほとんど知られていません。
胃癌は全身性疾患です。腫瘍負荷と抗腫瘍治療刺激による免疫反応は、異なる組織間で調整されます。術前化学療法を受けた患者に対する系統的免疫景観または Hiam-Galvez らによって記述された免疫マクロ環境の分析は、癌免疫および治療抵抗メカニズムを包括的に理解するために重要です。既存の系統的免疫 - 炎症指標、例えば好中球とリンパ球比（NLR）は、主に血液細胞計数に依存しており、それらの次元を制限しています。血清免疫プロテオミクスは、高濃度で全身性免疫の理想的な反映となるでしょう。この研究では、胃腺癌患者が術前、術中、術後に術前化学療法を受けた血清サンプルを収集し、抗体ベースのプロテオミクスプラットフォーム（Olink Target 96 Inflammation panel）を使用して彼らの免疫プロテオミクスを研究しました。また、これらの患者から手術切除された腫瘍サンプルを収集し、多重免疫蛍光（mIF）、免疫組織化学（IHC）、および RNA シーケンシング（RNA-seq）を組み合わせて腫瘍微小環境を評価しました。血清免疫プロテオミクスの動的変化と腫瘍微小環境との関連性を調査しました。術前化学療法を受けた患者の腫瘍縮小、全生存（OS）、および無進行生存（PFS）を予測するバイオマーカーを同定しました。
結果#
研究集団#
本研究には、術前化学療法を受け、その後胃切除手術を受けた 90 名の胃腺癌患者が含まれています（図 1A）。術前に免疫チェックポイント阻害剤（ICIs）を受けた患者は除外されました。適格な患者は、反応者（残存腫瘍 / 腫瘍床≤50% の化学療法効果、Becker TRG スコア 1–2）と非反応者（Becker TRG スコア 3）に分けられました。90 名の患者のうち、36 名（40%）が腫瘍縮小スコア 1–2 に達し、反応者と見なされました。腫瘍縮小程度が良好な患者は、非反応者と比較して全生存が有意に長かったです（図 S1A）。無進行生存も同様の傾向を示しましたが、統計的差異はありませんでした（図 S1B）。患者の基本的臨床特性は表 S1 にまとめられています。約半数の患者が二剤細胞毒性化学療法を受け、その大多数は SOX（S-1 とオキサリプラチン）または XELOX（カペシタビンとオキサリプラチン）プロトコルでした。残りの患者は三剤細胞毒性化学療法を受け、主に DOS（ドセタキセル、オキサリプラチン、S-1）プロトコルでした。2022 年 3 月 1 日の分析日までの中央値の追跡期間は 55.8 ヶ月（範囲 3.2 から 82.7 ヶ月）でした。全体集団において、中央値の無進行生存は 39.8 ヶ月（95% 信頼区間 [CI]、32.7 から未達 [NR]）、中央値の全生存は 63.9 ヶ月（95% CI、51.8 から 74.1）で、45 例が死亡しました（50%）。
血清免疫プロテオミクスの動的変化と術前化学療法反応の関連#
術前化学療法を受けた患者から 37 件の術前、8 件の術中、83 件の術後の血清サンプルが収集され、そのうち 30 件の術前と 30 件の術後の血清サンプルはペアでありました（図 1A）。Olink Target 96 Inflammation panel の近接拡張アッセイ（PEA）を使用して、主要な免疫および炎症経路における 92 のマーカータンパク質のレベルを測定しました。術前と術後の血清サンプル中のタンパク質レベルを比較すると、術前化学療法後の血清免疫プロテオミクスの動的変化が示されました。92 のタンパク質のうち 18 がペアおよび非ペアテストで有意な変化を示しました（図 1B、図 S1C および図 S1D）、これは術前化学療法が複雑な全身免疫反応を引き起こしたことを示しています。その中で、血清 C-X-C モチーフケモカインリガンド 1（CXCL1）および CXCL5 レベルは術前化学療法後に有意に低下しました（図 S1D）。興味深いことに、Zhou らは、CXCR2 リガンドとしての CXCL1 および CXCL5 が胃癌細胞の移動を有意に促進し、胃癌の転移を推進することを報告しています。化学療法は CXCL5 および CXCL1 の血清レベルを低下させることによって胃癌の転移を予防するのに寄与する可能性があります。実際、CXCL1/5 レベルは術前化学療法の初期サイクルで低下します（図 S1E）。
私たちはさらに、異なる治療反応患者の血清免疫プロテオミクスの動的変化を比較しました。反応者は治療後により動的な血清免疫プロテオミクスの変化を示しました（図 1C および 1D）。また、化学療法後の反応者と非反応者のタンパク質レベルの絶対変化を比較したところ、反応者では化学療法後に全体的により大きな変化が見られました（図 1E）。例えば、反応者と比較して、非反応者の治療後の血清 CXCL5 レベルの低下程度ははるかに軽微でした（図 1C–1F）。治療期間中のプロテオミクスは反応者と非反応者の間でも差異があるようです（図 S1E）。例えば、反応者では治療期間中の血清インターロイキン受容体サブユニット b（IL-10RB）および IL-18 レベルが化学療法の過程で上昇傾向を示しましたが、非反応者ではこの傾向は示されませんでした（図 S1F および図 S1G）、ただしこの部分の結論はサンプル数の制限を受ける可能性があります。
総じて、これらの結果は、胃腺癌患者における術前化学療法に対する複雑な全身性免疫反応が存在することを示しています。反応者は術前化学療法後にしばしばより動的な全身性免疫反応を示します。
腫瘍微小環境（TME）と患者の術前化学療法反応の関連#
まず、異なる治療反応患者からの腫瘍サンプルのトランスクリプトームを比較し、腫瘍の局所的特徴に関する一般的な知識を得ました。遺伝子セット富化解析（GSEA）は、良好な反応者における変化した特徴的経路を示しました（図 2A）。DNA 複製や細胞周期などの経路の変化は、癌細胞の増殖抑制および腫瘍退縮を示唆している可能性があります。さらに、半数近くの経路が免疫に関連しており、ケモカインシグナル経路やサイトカインとサイトカイン受容体相互作用経路（図 2B および図 2C）などが含まれており、化学療法における免疫の重要性を示しています。
したがって、私たちは手術切除された腫瘍サンプルにおいて地理的免疫景観を評価するために多重免疫蛍光（mIF）を使用しました。CD4、CD8、および Foxp3 染色を使用して異なるタイプの T 細胞を識別しました。CD68 および CD163 染色を使用してマクロファージを識別しました（図 2D）。反応者と非反応者の間の免疫浸潤を比較しました。CD68 + マクロファージおよび CD68+/CD163+ M2 マクロファージの細胞密度は非反応者において有意に高かったです（図 2E および図 S2A）。それに応じて、Xing らは、胃癌の新補助化学療法後に非反応者において CD68 + マクロファージの浸潤が高いことを報告しています。M2 マクロファージも多くの癌における化学療法耐性に関与していることが示されています。
同時に、私たちはコホートから 24 件の術前内視鏡生検サンプルを収集しました。術前 TME を mIF で分析しました（図 S2B）。注目すべきは、ほとんどの内視鏡生検が胃の表層粘膜のみを取得しており、これが腫瘍全体の代表性および手術切除組織との比較可能性を大きく制限していることです（図 S2C）。実際、mIF は術前 TME における免疫細胞浸潤が反応者と非反応者の間で差異がないことを示しました（修正された図 S2D）、これは生検の深さが限られていることや胃癌内の腫瘍の顕著な異質性による可能性があります。
全体として、これらの結果は術後 TME が術前化学療法の反応に関連していることを示しています。
血清免疫プロテオミクスと TME との関連性#
既存の癌免疫学研究のほとんどが腫瘍微小環境（TME）に集中しているため、私たちは全身免疫と TME との関連性を評価しました。また、血清免疫プロテオミクスと TME における免疫細胞浸潤との関連性も特定しました。興味深いことに、術後 TME は術前ではなく術後の血清免疫プロテオミクスとより関連しているようです。サンプル数が少ない場合でも、術前血清免疫プロテオミクスと免疫細胞浸潤との関連性は全体的により強いです（図 3A および図 3B）。例えば、術前血清線維芽細胞成長因子 21（FGF21）レベルが高いことは CD68 + マクロファージの浸潤が少ないことと関連し、術前血清転化成長因子 b1（TGF-b1）レベルが高いことは CD4+T 細胞の浸潤が多いことと関連しています（図 3C および図 3D）。実際、TGF-b は効果器および調節性 CD4 陽性細胞反応の調節において多様性を持つことが報告されています。術後血清免疫プロテオミクスと術後免疫細胞浸潤との関連性も観察されました。例えば、術前血清 C-C モチーフケモカインリガンド 11（CCL11）レベルが高いことは CD4+/FOXP3+ T 細胞の浸潤が多いことと関連しています（図 3E）。王らは CCL11 が乳癌において CD4+CD25+Foxp3 + 調節性 T 細胞（Tregs）の割合を増加させることを報告しています。CCL11 が胃癌において CD4+Foxp3+Treg 細胞機能を調節するかどうかを探るためにはさらなる研究が必要です。
私たちはまた、術後血清タンパク質レベルと 92 の免疫遺伝子の腫瘍 mRNA レベルとの関連性を評価しました。その中で 5 つの免疫遺伝子の関連性が統計的に有意であり、正の相関があるのは 2 つだけでした（図 3F および図 S3A–S3E）。TNFSF12 および CCL4 の関連性は実際には限界的でした（図 S3A および図 S3B）。血清タンパク質レベルと組織遺伝子 mRNA レベルとの関連性は全体的に弱いです。
これらの結果は、全身性免疫と腫瘍微小環境との相互通信および相互依存関係を示しています。腫瘍微小環境の研究は、免疫系が胃癌および抗腫瘍治療にどのように包括的に応答するかを十分に明らかにすることはできません。胃癌患者に対する系統的免疫分析を行うためには、さらなる努力が必要です。
古典的全身性免疫炎症指標の臨床的価値#
古典的全身性免疫炎症指標のほとんどは血液細胞比率に基づいており、患者の臨床結果と関連していることが示されています。私たちは血清免疫プロテオミクスと古典的全身性免疫炎症指標との関係に興味を持ちました。したがって、術後血清免疫プロテオミクスと古典的免疫炎症指標との関連性を評価しました。これには好中球とリンパ球比（NLR）、血小板とリンパ球比（PLR）、単球とリンパ球比（MLR）、および血小板分布幅（PDW）および一般的な血液細胞計数が含まれます。ほとんどの関連性は比較的弱いですが（図 S3F）、血清 CXCL5 および CXCL1 レベルは血小板数と強い相関を示しました（図 S3G および図 S3H）。CXCL1 および CXCL5 は通常、好中球の恒常性と機能に関与しているため、この予期しないが興味深い相関を理解するためにはさらなる研究が必要です。私たちはまた、古典的全身性免疫炎症指標と TME の特徴との関係を評価しました。術後の古典的免疫炎症指標と TME における免疫細胞浸潤との関連性は観察されませんでした（図 S3I）。
私たちは古典的全身性免疫炎症指標の臨床的価値をさらに探求し、好中球とリンパ球比（NLR）、血小板とリンパ球比（PLR）、単球とリンパ球比（MLR）、および血小板分布幅（PDW）の治療反応予測価値を評価しました。これら 4 つの指標の受信者動作特性（ROC）曲線を描き、最高の曲線下面積（AUC）は 0.602 でした（図 S3J）。比例ハザード回帰は、これら 4 つの指標の予後価値を示しました。単変量 Cox 回帰では、これらの指標は OS または PFS に対して有意な予後価値を示さなかったが、多変量 Cox 回帰では、NLR が高いことが短い OS と関連しており、ハザード比は 1.172（95% CI、1.0066–1.3639）でした（図 S3K および図 S3L）。それに応じて、以前の報告では NLR が胃食道接合部および胃腺癌の悪性予後因子であることが示されています。全体として、これら 4 つの指標の予後価値は限られています。
術後腫瘍基質 PD-L1 レベルと術前血清 PD-L1 レベルは術前化学療法反応を予測できる#
PD-L1 は重要な免疫調節分子です。PD-1 との相互作用時に PD-L1 は細胞毒性 T 細胞の免疫反応を抑制し、腫瘍免疫逃避に関与します。Choi らは CLASSIC 試験コホートに基づき、基質 PD-L1 レベルが II/III 期胃癌の D2 胃切除術後の補助化学療法効果を予測できると報告しました。PD1/PDL1 免疫組織化学染色に基づく類似のスコアリングシステムを利用して、非反応者が手術切除された腫瘍サンプルにおいて基質 PD-L1 染色スコアが高い傾向を示すことを発見しました（図 4A および図 4B）。基質 PD-1 染色も同様の傾向を示しましたが、これは統計的には有意ではありませんでした（図 S4A および図 S4B）。しかし、腫瘍領域の PD-L1 染色は治療反応と関連がありませんでした（図 4A）。これらの結果は腫瘍内の基質 PD-L1 レベルが術前化学療法の反応を予測できることを示しており、PD-1/PD-L1 経路が胃癌の化学療法抵抗に関与している可能性を示唆しています。
しかし、その遅延性により、術後基質 PD-L1 の反応予測価値は大きく制限される可能性があります。理想的な予測因子は術前のものであるべきです。術前内視鏡生検の基質 PD-L1 染色は治療反応を予測できませんでした（図 S4C および図 S4D）。したがって、術前血清 PD-L1 レベルの臨床的意義をさらに評価しました。興味深いことに、術前血清 PD-L1 レベルは異なる治療反応の患者間で差異を示しました（図 4C）。治療前に反応者の血清 PD-L1 レベルは低く、治療はこの差異を弱めたように見え、術後サンプルでは有意な差異は観察されませんでした（図 4E）。ROC 曲線を利用して術前および術後血清 PD-L1 レベルの治療反応予測価値を評価しました。術前血清 PD-L1 レベルの AUC は 0.737（95% CI、0.569–0.904）であり、術後血清 PD-L1 レベルの AUC は約 0.5 でした（図 4D および図 4F）、これは術前血清 PD-L1 レベルが術前化学療法の有望な治療反応予測因子であることを示しています。術前血清 PD-L1 レベルが高い（>5.084 標準化タンパク質発現 [NPX]）患者は、術前化学療法に対して悪い治療反応を示す傾向があります（図 S4E）。
私たちはまた、異なる治療反応患者の治療期間の血清 PD-L1 レベルを評価しました。反応者では、治療中に血清 PD-L1 が増加しているようです。反応者の治療期間の血清 PD-L1 レベルは有意に高かったです（図 S4F および図 S4G）。この差異の一因は腫瘍細胞の破壊かもしれません。さらなるサンプルと研究が必要であり、この発見を確認し、潜在的なメカニズムを明らかにする必要があります。PD-L1/PD-1 レベルと血清 PD-L1 レベルとの病理学的関連性も測定されました。異なるペアの中で、術前血清 PD-L1 レベルと術後基質 PD-1 レベルは最も強い関連性を示しました（図 S4H）。術前血清 PD-L1 レベルは化学療法後の腫瘍における PD-1 + 免疫細胞の浸潤と関連している可能性があります。
総じて、これらの結果は、術後腫瘍基質 PD-L1 レベルと術前血清 PD-L1 レベルが術前化学療法の反応を予測できることを示しており、術前血清 PD-L1 レベルはより大きな臨床的意義を持つべきです。
術前血清 CCL20 レベルが術前化学療法の反応を予測#
PD-L1 の発見に触発され、私たちは異なる治療反応患者の術前血清免疫プロテオミクスを比較し、10 種類のタンパク質が p <0.05 の差異を示しました。その中で、術前 CCL20 レベルは最も顕著な差異を示しました。注目すべきは、術前の治療反応患者の術後血清免疫プロテオミクスを比較したところ、術前サンプルと比較して差異がはるかに弱かったことです（図 S5A）。
最近の研究では、CCL20 がさまざまな癌における化学療法抵抗の重要な媒介物であることが確立されています。図 S5B に要約されているように、Chen らは、化学療法が核因子 kB（NF-kB）と CCL20 の間の正のフィードバックループを介して CCL20 を誘導し、乳癌における ATP 結合ボックスサブファミリー B メンバー 1（ABCB1）発現を上昇させることによって化学療法抵抗を媒介することを報告しました。Wang らは、化学療法が FOXO1/CEBPB/NF-kB シグナル経路を介して結腸直腸癌細胞における CCL20 を上昇させ、分泌された CCL20 が調節性 T 細胞を引き寄せ、化学療法抵抗を促進することを報告しました。Liu らは、シスプラチン刺激を受けた古典的活性化マクロファージ（CAMs）が CCL20 の生成を増加させることによって卵巣癌細胞の移動を促進することを報告しました。全体として、既存の研究は CCL20 の上昇が化学療法によって引き起こされ、増加した CCL20 の生成が化学療法抵抗を促進することを示唆しています。
しかし、私たちの研究は、上述のモデルが胃癌においては成立しない可能性があることを示しています。術前化学療法の反応者において、治療開始前の血清 CCL20 レベルは有意に低いことがわかりました（図 5B）。術前血清 CCL20 レベルは治療反応を予測し、AUC は 0.769（95% CI、0.614–0.925）でした（図 5C）、これは胃癌患者が治療前に血清 CCL20 レベルに差異があることを示しています。既存の研究結果と一致して、非反応者の腫瘍における CCL20 mRNA レベルは上昇しています（図 5D）。しかし、治療後の血清 CCL20 レベルは反応者と非反応者の間で差異がなく、血清と腫瘍の CCL20 レベルが切り離されていることを示しています（図 5E）。興味深いことに、沈らの報告に基づいて、切除可能な胃癌の血清および組織プロテオミクスを参照すると、胃癌患者の血清 CCL20 レベルは健康な人に対して上昇していることがわかりました（図 5F）。腫瘍サンプル中の CCL20 タンパク質レベルも正常な胃組織より高いです（図 S5C）。しかし、胃切除手術によって腫瘍を切除しても血清 CCL20 レベルは回復せず、むしろ血清 CCL20 レベルはさらに増加しました（図 5F）。これらの結果は、血清 CCL20 が腫瘍 CCL20 の全身的な反映ではなく、胃癌および化学療法に対する全身免疫の重要な構成要素であることを示しています。
私たちはまた、既存の研究が提案した CCL20 上昇のシグナルモデルを検証しました。Kim らは、第一線の標準化学療法を受けたが PD-1 阻害を受けていない患者から、治療前および治療中の胃生検サンプルを収集しました。私たちは彼らのトランスクリプトームデータを分析し、化学療法が腫瘍サンプル中の CCL20 mRNA レベルを増加させないことを発見しました。逆に、化学療法後に CCL20 mRNA レベルが低下しました（図 5G）。この発見は、CCL20 が胃癌において化学療法によって引き起こされるという仮定に挑戦します。同時に、ABCB1、CEBPB、および FOXO1 mRNA レベルは異なる反応の腫瘍間（図 5H）および化学療法前後の生検サンプル間（図 S5D）でも差異がありませんでした。逆に、術前血清 CCL20 レベルが高いことは腫瘍中の CD4+T 細胞の浸潤が少ないことと関連しています（図 S5E）。CD4+T 細胞は免疫応答を媒介し、腫瘍に対する調節および効果的な免疫応答を実現する上で重要です。同時に、術前血清 CCL20 レベルが高いことは、基質中の PD-1 + または PD-L1 + 細胞の浸潤が多いこととも関連しています（図 5I および図 S5F）、これは腫瘍免疫逃避の重要な媒介物であるべきです。全体として、これらの結果は血清 CCL20 が化学療法に対する全身免疫抑制環境を誘導することを示しています。
図 5J に要約されているように、既存の研究は腫瘍中の CCL20 の上昇が化学療法によって引き起こされ、増加した CCL20 の生成が化学療法抵抗を促進すると提案しています。しかし、私たちは化学療法開始前の患者の血清 CCL20 レベルに差異があることを発見しました。術前血清 CCL20 レベルが高い患者は、治療反応が悪い傾向があります。潜在的なメカニズムは、血清 CCL20 が全身的な免疫抑制環境を誘導することです。これらの発見は、術前血清 CCL20 レベルが高い患者において、免疫療法と化学療法の組み合わせがより効果的である可能性を示唆しています。CCR6-CCL20 軸（CCR6 は CCL20 の細胞受容体）の阻害剤を開発するために多くの努力が注がれています。抗体や拮抗剤を用いて CCR6-CCL20 軸を干渉することは、癌治療において潜在能力を示しています。術前血清 CCL20 レベルは、CCR6-CCL20 阻害剤から利益を得る可能性のある患者を選別するのに役立つかもしれません。さらに、これらの発見は、術前期が血清タンパク質バイオマーカーを通じて患者層別化を行うための不可欠な時間ウィンドウであることを示しています。したがって、私たちは術前化学療法反応を予測するための術前血清タンパク質の組み合わせをさらに確立することを決定しました。
術前化学療法反応を予測するための術前血清タンパク質スコアリングシステム#
異なる治療反応患者の術前血清タンパク質レベルを比較することによって（図 5A）、私たちは 15 の p<0.1 のタンパク質を一貫性クラスタリングに含めました。一貫性累積分布関数（CDF）図、増分面積図、および一貫性行列の手動チェックに基づいて、私たちは 4 つの術前血清サブタイプを発見しました（図 6A、6B および図 S6A–S6H）。その中で、クラスター 2 は患者の明らかに良好な治療反応と関連していました（図 6C）。この無審査のクラスタリングは、腫瘍の Lauren 分類など、患者の臨床的特徴とも関連していました。クラスター 1 および 4 は、より高い割合の腺癌腫瘍タイプと関連しています（図 6D）。
臨床的実用性を考慮し、私たちは最小絶対値収縮および選択演算子（LASSO）モデルを使用して、術前化学療法反応を予測するための術前血清反応予測スコア（PSRscore）を構築しました（図 S6I および S6J）。簡単に言えば、LASSO 回帰は収縮を使用して変数選択またはパラメータ除去を行う線形回帰の一種です。適切な l 値を使用して、PSRscore の公式は 4 つのタンパク質の血清レベルに制限されます：CCL3、IL-15Ra、CXCL5 および CCL20（図 6F および図 S6K）。PSRscore の ROC 曲線は、AUC が 0.907（95% CI、0.814–1.000）であり、カットオフ値は - 0.843 でした（図 6E）。患者は PSRscore 高群と低群に分けられました（図 6F）。低 PSRscore は明らかに悪い治療反応と関連していました（図 6G）。さらに、PSRscore が低い患者は術後腫瘍において数値的により多くの PD1+/PD-L1 + 細胞の基質浸潤およびより高い腫瘍 PD-L1 染色を示しました（図 6H および図 S6L）、これは通常、抗 PD-1/PD-L1 療法の適応症を引き起こします。
CCL20 の他に、PSRscore には CCL3、IL-15Ra および CXCL5 の術前血清レベルも含まれています。血清 CCL3 および IL-15Ra レベルが高く、CXCL5 レベルが低いことは、より悪い治療反応と関連しています（図 S6K）。研究は、CCL3 がさまざまな癌における免疫逃避および化学療法抵抗に関与していることを示しています。高レベルの CCL3 は Tregs、腫瘍関連マクロファージ（TAMs）、および骨髄由来抑制細胞（MDSCs）の腫瘍内浸潤の増加と関連しています。CCL3 駆動の TAMs の募集は転移性巣の駆動イベントと見なされています。CCL3 の中和抗体および阻害剤が開発され、抗癌治療において潜在能力を示しています。IL-15Ra および CXCL5 の化学療法抵抗における役割についての理解は限られており、胃癌におけるそれらの機能を探るためにはさらなる研究が必要です。
PSRscore スコアリングシステムは、胃腺癌患者の層別化に役立ち、術前化学療法から利益を得られない可能性のある患者を選別するのに役立ちます。この患者群に対して、私たちの研究は、患者が免疫療法の組み合わせから利益を得る可能性があることを強く示唆しています。免疫チェックポイント阻害剤（ICIs）や CCL3/20 の中和抗体 / 阻害剤のような治療法が考案される可能性があります（図 6I）。この戦略を検証するために前向き試験を設計することができ、このスコアリングシステムの感度と特異性を検証するために検証コホートを確立する必要があります。
TME および血清免疫プロテオミクスの予後価値#
私たちはさらに TME および血清免疫プロテオミクスの予後価値を評価しました。単変量 Cox 回帰で予測価値を持つすべての基本的臨床特徴および年齢と性別を含む多変量 Cox 回帰が行われました（表 S2 および S3）。OS または PFS の予測因子として表示される免疫細胞は、そのリスク比と共に森林図に示されています（図 S7A および S7B）。代表的な生存予測因子の Kaplan-Meier 曲線が描かれました（図 S7C–S7F）。免疫細胞タイプの中で OS の独立予測因子はなく、CD68 + マクロファージの浸潤は log rank テスト、単変量 Cox 回帰および多変量 Cox 回帰によって PFS の短縮を予測することが確認されました（図 S7C）。独立したものではありませんが、CD68 + マクロファージの浸潤は log rank テストによって OS の悪性予後因子としても示されました（図 S7D）。
OS または PFS の予測因子として表示される術前および術後血清タンパク質も森林図に示され、そのリスク比と共に示されています（図 7A、7B、S7G および S7H）。代表的な生存予測因子の Kaplan-Meier 曲線が描かれました（図 7C、7D、S7I および S7J）。その中で、術後血清 IL-10RB レベルが高いことは、OS および PFS の両方が有意に短縮されることと関連しており、log rank テスト、単変量 Cox 回帰および多変量 Cox 回帰によって確認されました（図 7C および 7D）。これは術後血清 IL-10RB レベルが術前化学療法を受ける患者の強力な悪性生存予測因子であることを示しています。注目すべきは、術後 IL-10RB レベルが術前化学療法後に有意に上昇し、術前化学療法の反応に関与している可能性があることです（図 S1D）。IL-10 シグナルが胃癌において果たす役割についての研究はまだ限られています。IL-10RB が胃癌の術前治療において果たす役割を理解するためには、さらなる研究が必要です。
議論#
過去 10 年間、癌における免疫の役割を明らかにするための努力が続けられてきました。免疫療法は胃癌治療において突破口を開き、免疫チェックポイント阻害剤は進行胃癌または食道腺癌の一線治療法となっています。しかし、胃癌の周術期治療において、現在のところ化学療法の主導的地位に挑戦する治療法は成功していません。免疫は、患者が周術期化学療法から利益を得る上で重要な役割を果たすと考えられています。既存の研究は腫瘍微小環境における局所免疫反応に焦点を当てていますが、胃癌免疫の改善理解は全身免疫を特に評価する必要があります。私たちは血清免疫プロテオミクスと古典的全身性免疫炎症指標を使用して全身免疫を記述し、それが腫瘍微小環境および治療反応との関連を研究しました。私たちは周術期治療が複雑な全身性免疫反応を誘発することを発見し、これは動的な免疫プロテオミクスとして現れます。同時に、治療反応が良好な患者は治療後により動的な血清免疫プロテオミクスの変化を示しました。腫瘍微小環境も周術期化学療法の反応に関連していることが示されました。しかし、治療開始前に潜在的な治療反応を予測することがより実用的です。興味深いことに、私たちは PD-L1 および CCL20 の術前血清レベルが周術期化学療法反応の予測因子であることを発見し、免疫抑制におけるそれらの既知の役割と一致しています。反応を予測するための術前血清プロテオミクスパネルがさらに確立され、周術期化学療法に単独で反応しない可能性のある患者を正確に選別できるようになりました。この患者群に対して、私たちは彼らが免疫療法と化学療法の併用治療から利益を得ると信じています。同時に、IL-10RB の術後血清レベルも胃癌患者の予後の強力な予測因子として確認されました。
腫瘍内 PD-L1 が免疫抑制および化学療法抵抗において果たす役割は確認されています。しかし、可溶性 PD-L1 に関する研究は限られています。私たちの研究は、化学療法開始前に患者の血清 PD-L1 レベルに差異があることを発見しました。化学療法に反応する患者は、しばしば低い血清 PD-L1 レベルを示します。可溶性 PD-L1 が化学療法抵抗において果たす役割についてはさらなる研究が必要です。CCL20 においても同様の発見があり、これはさまざまな癌の化学療法抵抗に関与していることが知られているケモカインです。私たちの研究は、他の癌タイプで提案された CCL20 誘導の化学療法抵抗モデルが胃癌においては成立しない可能性があることを示しています。CCL20 の変化を化学療法の結果と見なすことは、臨床医が治療前に患者を層別化し介入する能力を奪います。逆に、私たちの発見は、化学療法開始前に化学療法に対する異なる反応を示す患者が血清免疫プロテオミクスにおいて差異があることを示しており、患者の層別化と介入の時間ウィンドウを前倒しにします。PD-L1 および CCL20 の発見に触発され、私たちは周術期化学療法反応を予測するための術前血清プロテオミクスパネル、PSRscore を開発しました。4 種類の免疫タンパク質の術前血清タンパク質レベルを計算することによって、患者は 2 つのグループに分けられます。PSRscore が低い患者は、しばしば悪い治療反応を示し、免疫療法の併用治療から利益を得る可能性があります。このスコアリングシステムは、患者の層別化において大きな臨床応用の可能性を持っています。注目すべきは、PSRscore の確立がプラチナ系化学療法を受けたアジアのコホートに基づいていることです。これらの免疫バイオマーカーがタキサンベースのプロトコルを受ける非アジア患者においてどのように機能するかは、さらなる検証が必要です。
私たちは血清タンパク質バイオマーカーが胃癌患者の術前層別化において特別な臨床的意義を持つと信じています。ほとんどすべての既存の胃癌分子分類は、手術または内視鏡切除された腫瘍組織に依存しています。TCGA 分類が最も有名な例であり、マイクロサテライト不安定性（MSI）型患者は免疫療法から利益を得やすいことが示されていますが、ゲノム安定性（GS）型患者は化学療法に対する反応が悪いです。しかし、これらの分子分類は臨床実践でほとんど使用されていません。重要な理由の一つは、ほとんどの分子分類が qPCR、原位ハイブリダイゼーション、さらにはオミクス技術などの複雑な分子技術に依存しており、これはほとんどの臨床で入手できないからです。さらに、胃癌では術前に腫瘍サンプルを取得することが内視鏡生検に依存しています。胃癌には顕著な腫瘍内異質性があり、生検の深さが限られているため、生検サンプルの代表性に大きく影響します。したがって、胃切除術の前に胃癌の分子分類を特定することは非常に困難でした。対照的に、血清プロテオミクスは全身的および腫瘍局所的特徴をカバーしているため、感度と情報性を持っています。臨床では血清サンプルを容易に取得でき、患者に対する損傷は限られています。前立腺特異的抗原（PSA）や α- フェトプロテイン（AFP）などの血清タンパク質バイオマーカーは、癌の診断やフォローアップに数十年にわたって使用されています。さまざまな病院で血清タンパク質を測定するための装置や訓練を受けたスタッフが広く提供されています。これらの要因は、胃癌における血清プロテオミクス研究に臨床的に大きな意義を与えています。将来的には、胃癌の血清タンパク質分類を確立し、胃癌の周術期治療を指導する必要があります。
制限事項#
研究には注意すべきいくつかの制限があります。まず、治療中の血清サンプルの数が比較的少なく、特定の結論を導く統計的能力を制限しています。次に、多重免疫蛍光（mIF）は腫瘍微小環境（TME）における重要な免疫細胞のみを測定しました。単細胞シーケンシングは TME をより良く描写できます。第三に、本研究のいくつかの結論と提案は、術前化学療法を受けた患者の前向きコホートやランダム化対照試験でさらに検証されるべきです。データを解釈する際には、これらの制限を考慮する必要があります。
全体として、私たちは胃癌患者の全身免疫系と腫瘍微小環境を記述し、それらが術前化学療法反応と関連していることを示しました。私たちは治療反応と予後を予測するための血清バイオマーカーを同定しました。この作業は、胃癌術前化学療法における全身免疫の基本的だが大いに過小評価されている役割を強調し、術前血清免疫プロテオミクスに基づく患者層別化戦略を支持し、今後の研究において免疫を包括的に描写する重要性を強調しています。